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摘要
背景：全長轉(zhuǎn)錄組能夠檢測癌細(xì)胞中異常剪接異構(gòu)體的結(jié)構(gòu)。這些亞型有時候被翻譯，被人類白細(xì)胞抗原（HLA）分子呈現(xiàn)，并被識別為新抗原。該研究使用(MinION)構(gòu)建了一個非小細(xì)胞肺癌中異常剪接的目錄，通過該目錄可以識別新亞型和潛在的新抗原。
結(jié)果：對22組細(xì)胞系進(jìn)行全長轉(zhuǎn)錄組測序，共鑒定出2021種新的剪接異構(gòu)體。其中一些異構(gòu)體的蛋白質(zhì)表達(dá)通過蛋白質(zhì)組分析進(jìn)行驗(yàn)證。無義介導(dǎo)的mRNA衰減因子(NMD)UPF1的降低和剪接因子SF3B1的減少增加了異常轉(zhuǎn)錄本的比例。NetMHC對每種HLA分子結(jié)合的親和力的評估顯示，一些亞型可能產(chǎn)生新抗原候選體，還在7個非小細(xì)胞肺癌標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)了剪接亞型。酶聯(lián)免疫吸附斑點(diǎn)試驗(yàn)表明，大約一半的候選肽有可能通過與人類白細(xì)胞抗原分子的相互作用激活T細(xì)胞反應(yīng)。大約一半的多肽通過與HLA分子的相互作用具有激活T細(xì)胞反應(yīng)的潛力。最后，作者通過參考構(gòu)建的目錄來估計(jì)癌癥基因組圖譜(TCGA)數(shù)據(jù)庫中的亞型數(shù)量，發(fā)現(xiàn)NMD因子的破壞與TCGA-Lung Adenocarcinoma數(shù)據(jù)集中發(fā)現(xiàn)的剪接亞型數(shù)量顯著相關(guān)。
結(jié)論：結(jié)果表明，全長轉(zhuǎn)錄組測序?qū)τ凇檀_鑒定癌細(xì)胞中異常轉(zhuǎn)錄本至關(guān)重要。
材料和方法
實(shí)驗(yàn)材料：22組肺腺癌細(xì)胞系（A427、A549、ABC-1、H1299、H1437、H1648、H1650、H1819、H2126、H2228、H2347、H322、II-18、PC-14、PC-3、PC-9、RERF-LC-Ad1、RERF-LC-Ad2、RERF-LC-MS、RERF-LC-OK、RERF-LC-KJ和VMRC-LCD）
實(shí)驗(yàn)方法：全長轉(zhuǎn)錄組測序、RNA-seq測序
結(jié)果
1.肺癌細(xì)胞系的全長轉(zhuǎn)錄本
對22個NSCLC細(xì)胞系進(jìn)行了全長轉(zhuǎn)錄組測序，其中肺癌特征基因組表達(dá)的突變和轉(zhuǎn)錄組本被表示。從每個細(xì)胞系中平均產(chǎn)生了350萬條reads，平均reads長度為1.6 kb，獲得的全長cDNA片段通過Minimap2測序與人類基因組比對。所有的剪接位點(diǎn)都通過二代轉(zhuǎn)錄組測序確認(rèn)。將獲得的可變剪接進(jìn)一步與參考序列數(shù)據(jù)庫(RefSeq)當(dāng)前的轉(zhuǎn)錄本模型進(jìn)行比較。在映射到RefSeq轉(zhuǎn)錄本的reads中，超過50%的reads成功覆蓋了多達(dá)8000個基因的全長轉(zhuǎn)錄本。對于每個基因，MinION的reads(RPM)與二代轉(zhuǎn)錄本reads(TPM)具有很強(qiáng)的相關(guān)性。
文章鑒定了轉(zhuǎn)錄異構(gòu)體的完整外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)，并將其分為以下類型：未標(biāo)記外顯子、外顯子跳躍、互斥外顯子、內(nèi)含子保留、5’可變外顯子和3’可變外顯子(圖 1a)。因此，文章從所有細(xì)胞系中鑒定出3474種非RefSeq亞型，并將它們命名為假定的“異常剪接亞型”，以下簡稱為“亞型”，2021種亞型包含至少一個在參考序列或基因代碼數(shù)據(jù)集中沒有出現(xiàn)的剪接事件(圖1b)。還在單個全長轉(zhuǎn)錄本上鑒定了這些剪接事件的新組合，這很難通過短reads測序數(shù)據(jù)的片段reads檢測到。
Fig. 1
每種非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系的模式和數(shù)量代表特征性異常剪接事件(圖一d)。轉(zhuǎn)錄本的數(shù)量從323到725不等。不同細(xì)胞系的轉(zhuǎn)錄本組成不同。例如，內(nèi)含子保留和替代的最后一個外顯子構(gòu)成了RERF-LC-Ad2中大比例的同種類型，而未標(biāo)記的外顯子和外顯子跳躍是H1819的特征。這些結(jié)果表明，即使在細(xì)胞系中，異常剪接轉(zhuǎn)錄本的模式也是多樣的。剪接事件的一個新的復(fù)雜組合轉(zhuǎn)錄本的例子如圖1e所示。CTSV在ABC-1細(xì)胞中表達(dá)了兩種亞型，其中一種包括發(fā)生在外顯子2和3之間的替代性最后一個外顯子和內(nèi)含子保留的組合。
還觀察到具有多種亞型的基因。例如，HNRNPA2B1顯示了在PC-3細(xì)胞的3’UTR內(nèi)包含選擇性剪接事件的四種亞型(圖1f)。作者總共鑒定了663個具有多種亞型的基因(圖1g)。這些結(jié)果反映了全長轉(zhuǎn)錄組測序在全面檢測新的復(fù)雜亞型方面的巨大潛力。
為了驗(yàn)證計(jì)算的準(zhǔn)確性，比較流程和TALON軟件檢測到的可變剪接。在計(jì)算流程中檢測到的725種轉(zhuǎn)錄本中有708種(98%)也在TALON中檢測到，其中676種(93%)成功通過了TALON的過濾條件(圖1h)。TALON檢測不到的17種亞型由reads糾錯工具校正。雖然僅在TALON中檢測到21，745種亞型，但99%的亞型被作者之前的過濾條件過濾掉的reads所覆蓋(歸因于不明確的比對或低表達(dá)水平，數(shù)據(jù)未顯示)。作者的過濾條件旨在避免假陽性檢測，并保留更高表達(dá)的轉(zhuǎn)錄本，這些轉(zhuǎn)錄本可以翻譯成新抗原；因此，作者的流程提取了比TALON提取的亞型更保守的亞型。
為了確認(rèn)重復(fù)位點(diǎn)導(dǎo)致reads錯位的影響，作者評估了22個細(xì)胞系中檢測到的5508個剪接節(jié)點(diǎn)。作者提在剪接位點(diǎn)周圍50 bp的區(qū)域，使用repeatmask搜索重復(fù)區(qū)域，結(jié)果，94.9%的拼接位點(diǎn)沒有重疊重復(fù)序。這一結(jié)果表明，新的剪接位點(diǎn)與重復(fù)序列并不特別相關(guān)。
2.檢測到的轉(zhuǎn)錄本
作者進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)了新的轉(zhuǎn)錄本，發(fā)現(xiàn)45%的轉(zhuǎn)錄本在細(xì)胞系中共有，在每個細(xì)胞系獨(dú)有1894種轉(zhuǎn)錄本(圖2a)。共有1354個基因在兩個或多個細(xì)胞系中含有異常剪接轉(zhuǎn)錄本(圖2b)。
為了表明富含同種亞型的基因，作者比較了有或無的同種亞型基因長度、外顯子數(shù)量和表達(dá)水平。與不含同種亞型的基因相比，含有至少一種同亞型的基因顯示出更短的序列長度，并且由較少數(shù)量的外顯子組成；然而，發(fā)現(xiàn)含有同種亞型的基因的表達(dá)水平明顯升高。作者還發(fā)現(xiàn)，同種亞型的多樣性與基因長度和表達(dá)水平有關(guān)。具有一種同種亞型的細(xì)胞系的基因顯示了具有兩種或多種同種亞型在基因長度和表達(dá)水平上的顯著差異。例如，在VMRC-LCD中，富含同種亞型的基因往往比只有一種同亞型的基因長度更短，表達(dá)量更高(圖2c–e)。
為了檢驗(yàn)表達(dá)水平和檢測概率的關(guān)系，作者將VMRC-LCD細(xì)胞的測序reads再抽樣至1/2、1/5、1/10、1/50和1/100(n= 100)并計(jì)算每個亞型的檢測概率。作者將這些亞型分為三類，高、中、低，三類中的每一類如下:(1)基因的TPM(總基因表達(dá))，它是根據(jù)短reads RNA測序數(shù)據(jù)；(2)isoform-reads ratio(基因內(nèi)的轉(zhuǎn)錄本頻率)；(3)isoform-reads。因此，作者發(fā)現(xiàn)三類isoform在“TPM”和“isoform-reads ratio”類別中顯示出相似的檢測概率，這表明isoform檢測在某種程度上與這些類別無關(guān)。然而，在本研究進(jìn)行的測序深度中，每個病例似乎都達(dá)到了飽和狀態(tài)。平均單個肺癌細(xì)胞中有360000個mRNA分子。因此，每個細(xì)胞一個mRNA拷貝相當(dāng)于3個TPM。在VMRC-LCD中，檢測到至少一種亞型的基因的*小TPM為6 TPM。這些事實(shí)表明，作者能夠識別細(xì)胞內(nèi)表達(dá)水平非常低的亞型。
作者還使用具有至少一種轉(zhuǎn)錄本靶基因進(jìn)行了基因本體分析，發(fā)現(xiàn)參與翻譯途徑的RNA結(jié)合蛋白顯著富集。這一結(jié)果與先前對MDS臨床標(biāo)本的研究一致。該報道研究了患有SF3B1、U2AF1和SRSF2突變的患者中的異常剪接事件。一些核糖體蛋白基因和剪接相關(guān)基因的表達(dá)通常通過可變剪接事件來調(diào)控，因此可能容易受到可變剪接的影響。一般來說，核糖體蛋白基因比其他基因更短，表達(dá)水平更高。這一特征可能導(dǎo)致富含轉(zhuǎn)錄本的基因具有較短的基因長度和較高的表達(dá)水平(圖2c–e)。
在細(xì)胞系中，未發(fā)現(xiàn)異常剪接異構(gòu)體數(shù)量與EGFR、KRAS或NRAS驅(qū)動基因突變之間存在顯著關(guān)聯(lián)(圖2g)。值得注意的是，作者發(fā)現(xiàn)異常剪接異構(gòu)體的數(shù)量與基因組TMB相關(guān)性較差，而TMB是新抗原的來源，也是ICI有效性的已知標(biāo)記之一(r = 0.3，圖2h)。本研究檢測到的異常剪接異構(gòu)體也可能被翻譯并作為新抗原呈現(xiàn)。
Fig. 2
3.異常剪接異構(gòu)體的生物學(xué)驗(yàn)證
接下來，作者研究了癌細(xì)胞中異常剪接轉(zhuǎn)錄本的潛在原因。由于作者能夠?qū)⑥D(zhuǎn)錄本作為全長轉(zhuǎn)錄本的一種形式進(jìn)行分析，作者計(jì)算了含有PTCs的異常轉(zhuǎn)錄本，它們可能是NMD的靶點(diǎn)。作者發(fā)現(xiàn)約30%的異常亞型含有PTCs(圖3)。事實(shí)上，當(dāng)作者檢查VMRC-LCD的情況時，它顯示了高數(shù)量的異常剪接異構(gòu)體，作者發(fā)現(xiàn)這個細(xì)胞系含有一個剪接位點(diǎn)突變UPF1，這是一個關(guān)鍵的NMD因子。為了更直接地驗(yàn)證異常轉(zhuǎn)錄本積累的原因，作者在UPF1中對A549進(jìn)行了siRNA敲除(圖3b)。作者同樣結(jié)合Illumina平臺RNA測序數(shù)據(jù)分析了獲得的全長cDNA MinION reads。正如預(yù)期的那樣，UPF1敲除顯著增加了nmd靶向異構(gòu)體的比例(圖3c)。例如，SURF2基因中內(nèi)含子保留的亞型僅在UPF1敲除細(xì)胞中檢測到，盡管該亞型含有PTC并可能被NMD靶向(圖3d)。為了驗(yàn)證這種異構(gòu)體在upf1缺失細(xì)胞中的特異性表達(dá)，作者使用引物進(jìn)行RT-PCR。SURF2外顯子2的5剪接位點(diǎn)對UPF1敲除實(shí)驗(yàn)的響應(yīng)增加了兩到三倍(圖3e)。這種增加也被檢測到在PCR產(chǎn)物之間的大小差異。
SF3B1是一種眾所周知的剪接因子，在多種疾病中發(fā)生突變，并導(dǎo)致異常剪接亞型的增加。作者通過SF3B1敲除評估剪接損傷的影響以及研究剪接因子的畸變是否影響轉(zhuǎn)錄本的產(chǎn)生。作者發(fā)現(xiàn)外顯子跳躍的比例顯著增加(圖3f)，例如，PSMD7的外顯子3和6 在敲除后被改變(圖3g)。SF3B1-depleted的A549細(xì)胞中，外顯子跳躍亞型的表達(dá)PSMD7在中顯著增加，相反，RefSeq類型減少。為了確認(rèn)剪接位點(diǎn)近端區(qū)域的共有序列，作者收集了僅在SF3B1在A549細(xì)胞中敲除檢測到的外顯子跳躍異構(gòu)體。在這項(xiàng)分析中，作者用新的剪接連接的10 bp的區(qū)域，并跳過了外顯子。具有外顯子跳躍亞型的基因在翻譯和泛素-蛋白酶體途徑中顯示出顯著的富集，因此，這些因素的中斷可能會改變至少一些異常剪接亞型，并可能導(dǎo)致它們在肺癌細(xì)胞中的積累。
K700E是位于SF3B1 的HEAT-repeat區(qū)域常見的突變之一。如先前的研究所示，K700E熱點(diǎn)突變下調(diào)內(nèi)含子保留并上調(diào)替代3’剪接位點(diǎn)事件。除了外顯子跳躍，較受影響的是內(nèi)含子保留。這個結(jié)果和預(yù)期一致，因?yàn)樗徽J(rèn)為會對SF3B1產(chǎn)生相反的結(jié)果。其他3’剪接位點(diǎn)事件沒有受到顯著影響，這并不總是與之前的結(jié)果一致，這表明其他細(xì)胞環(huán)境也起作用。
Fig. 3
4. 異常轉(zhuǎn)錄本作為產(chǎn)生新抗原的潛在模板
據(jù)報道，腫瘤中積累的異常剪接轉(zhuǎn)錄本可能是新抗原的來源。為了研究檢測到的轉(zhuǎn)錄本是否可以作為新抗原，作者試圖分析由這些異常剪接轉(zhuǎn)錄本編碼的異常肽的潛在抗原性。在多肽方面，通過考慮所有可能的 9-mer肽的全長轉(zhuǎn)錄本結(jié)構(gòu)，推導(dǎo)出轉(zhuǎn)錄本的改變的多肽序列。事實(shí)上，異常剪接轉(zhuǎn)錄本通過引起移碼或翻譯的早期終止而頻繁而劇烈地改變蛋白質(zhì)序列。這些新抗原在大多數(shù)細(xì)胞系中占總潛在新抗原的*大比例(圖4a)，異常剪接轉(zhuǎn)錄本和移碼突變導(dǎo)致了更多新多肽的產(chǎn)生(圖4b)。正如預(yù)期的那樣，被NetMHC預(yù)測為“強(qiáng)結(jié)合物”的新抗原的數(shù)量在剪接轉(zhuǎn)錄本和移碼突變中也更多(圖4c)。在對來自每種肽的*高NetMHC比較中，來自那些異常亞型的肽顯示出比通常使用TMB檢測方法鑒定的錯義和內(nèi)突變的多肽更高的評分分布(圖4d)。
為了從實(shí)驗(yàn)上驗(yàn)證異常的轉(zhuǎn)錄本是否被翻譯成蛋白質(zhì)，對11種細(xì)胞系(A427、A549、H1650、H2228、II-18、PC-9、RERF-LC-Ad1、RERF-LC-Ad2、RERF-LC-KJ、RERF-LC-MS和VMRC-LCD)采用了使用液相色譜結(jié)合串聯(lián)質(zhì)譜(LC/MS/MS)對于多肽識別，作者基于每個細(xì)胞系的MinION數(shù)據(jù)定制了肽序列數(shù)據(jù)庫。如前所述，普通轉(zhuǎn)錄組測序由于其測序能力，顯示出比LC/MS/MS蛋白質(zhì)組學(xué)更高的基因覆蓋率。通過液相色譜/質(zhì)譜/蛋白質(zhì)組學(xué)檢測的每個基因的肽數(shù)與通過轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)計(jì)算的TPM相關(guān)(r= 0.52，圖4e)而且LC/MS/MS蛋白質(zhì)組學(xué)檢測到的大部分基因也被轉(zhuǎn)錄組測序覆蓋(圖4f)。作者成功地檢測到7個翻譯自異常剪接亞型特異性區(qū)域的多肽。例如，衍生自外顯子3中具有選擇性5’剪接的轉(zhuǎn)錄本的多肽KRT7存在于RERF-LC-Ad1(圖4g)。在GENCODE數(shù)據(jù)庫中沒有發(fā)現(xiàn)這種轉(zhuǎn)錄本，但是在ENST00000547613中觀察到了這種同中型特異性連接，其被認(rèn)為是處理過的轉(zhuǎn)錄本。MinION也證實(shí)了在H1437、H2126和II-18中的表達(dá)(表1).此外，這種轉(zhuǎn)錄本有可能產(chǎn)生幾個新抗原，這些新抗原是由NetMHC預(yù)測的。這些結(jié)果表明，一些異常剪接亞型被真正翻譯成肽，并可能在癌癥中產(chǎn)生新抗原中發(fā)揮作用。
Fig. 4
5.肺癌標(biāo)本中的異常剪接異構(gòu)體
為了檢查體內(nèi)癌細(xì)胞中是否也存在異常剪接轉(zhuǎn)錄本，作者接下來分析了臨床肺癌標(biāo)本。應(yīng)用與臨床樣本細(xì)胞系分析相同的分析方案，能夠識別每個患者的異常剪接亞型(圖5a)。作者選擇了在腫瘤樣本中表達(dá)水平比非腫瘤樣本高至少兩倍的轉(zhuǎn)錄本(圖5b)在所有臨床樣本中鑒定出982種富含癌癥的剪接亞型。其中，448種亞型在參考序列或基因代碼。異常亞型的數(shù)量和TMB之間沒有顯著的相關(guān)性(圖5c)。作為檢測到的轉(zhuǎn)錄本的一個例子，在SMOC2如圖1所示5d和僅在病例3的腫瘤中表達(dá)。類似于細(xì)胞系分析的結(jié)果，作者可以識別獨(dú)立剪接事件的幾種獨(dú)特組合模式，這些模式占這些未標(biāo)記亞型的14.5%。還確定了保留在癌細(xì)胞中的潛在的NMD靶向亞型，這表明NMD機(jī)制在相應(yīng)的癌癥中被破壞。值得注意的是，在病例3和4中，發(fā)現(xiàn)*大數(shù)量的潛在NMD靶向亞型在關(guān)鍵NMD因子中存在移碼或無義突變，UPF3B和SMG8(圖5a)。
與用于分析細(xì)胞系數(shù)據(jù)集的方法類似，進(jìn)行了NetMHC分析以鑒定可能是潛在新抗原的多肽。為此，作者使用臨床樣本的基因組測序數(shù)據(jù)。作者在每個病例中檢測到101–255個新抗原候選物(圖5e)。作者發(fā)現(xiàn)，與來自錯義突變的多肽相比，來自剪接轉(zhuǎn)錄本的肽顯示出更高的分布分?jǐn)?shù)(圖5f)。事實(shí)上，在大多數(shù)樣品中，它們占了總新抗原候選肽的大部分(圖5e)。這些結(jié)果支持了這樣一個事實(shí)，即臨床樣本中的異常剪接事件可以被MinION檢測到，并且比錯義突變更有可能產(chǎn)生更多的新抗原候選肽。
Fig. 5
6.對臨床樣本中異常剪接異構(gòu)體的評估
為了評估從異常剪接亞型和移碼突變中鑒定的肽的抗原性，作者根據(jù)圖6a所示的方案用候選肽免疫HLA-A24轉(zhuǎn)基因小鼠。作者根據(jù)人類白細(xì)胞抗原-α:24:02的網(wǎng)絡(luò)MHC評分選擇了17種候選肽(表2)。作者通過BLAST-P證實(shí)了該肽序列與人或小鼠蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中的序列沒有相似性，最后一次接種疫苗一周后，作者從小鼠中分離出脾細(xì)胞，并對分離物進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附斑點(diǎn)(ELISpot)分析。通過這樣做，作者試圖檢測新抗原特異性脾淋巴細(xì)胞反應(yīng)。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)結(jié)果顯示，17個多肽中有8個誘導(dǎo)顯著高的干擾素-γ產(chǎn)生(n= 2)與PBS組和單獨(dú)佐劑組相比(圖6b，c)。這些結(jié)果表明，來自剪接亞型和移碼突變的多肽可以通過與人類白細(xì)胞抗原的相互作用激活T細(xì)胞反應(yīng)。
Fig. 6
結(jié)論
在這項(xiàng)研究中，作者指出腫瘤中全長轉(zhuǎn)錄組測序?qū)τ凇檀_識別被普通轉(zhuǎn)錄組測序忽略的異常轉(zhuǎn)錄結(jié)構(gòu)至關(guān)重要。異常剪接亞型顯示出在腫瘤中產(chǎn)生大量新抗原的巨大潛力。從全長轉(zhuǎn)錄組測序中獲得的這些新的轉(zhuǎn)錄本特征將有助于評估腫瘤免疫治療的結(jié)果，當(dāng)與目前僅使用基因組突變的指標(biāo)結(jié)合使用時，這可能會提高免疫治療應(yīng)答預(yù)測的準(zhǔn)確性。
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